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Decisões Estratégicas: Gene Targeted ou Transgenic Model Extraído e modificado de Conlon RA (2018) Neuromethods: Transgênicos e Gene Targeted Models of Dementia. Springer Science Modelos animais de doenças em camundongos manipulados geneticamente são ferramentas poderosas na pesquisa médica, incluindo o estudo da demência. O tempo e o custo necessários para produzir camundongos geneticamente alterados são consideráveis ​​e a importância desse investimento é ampliada pelo longo período de estudos da demência. Os investigadores precisam ser capazes de fazer escolhas informadas sobre as diferentes estratégias de transgênicos e segmentação gênica, a fim de minimizar a variação indesejada e maximizar a fidelidade à doença. Nos últimos anos, grandes fragmentos genômicos clonados de forma estável em bibliotecas bem caracterizadas, os meios para manipular sua seqüência, e a capacidade de fazer camundongos transgênicos desses clones em linhagens inatas demonstraram aumentar o poder do mouse transgênico. Além disso, as novas linhas de células embrionárias da cepa de ratos C57BL6 de camundongos tornaram-se amplamente adotadas para a segmentação gênica, permitindo que knockins, knockouts e alelos condicionais sejam estabelecidos no padrão C57BL6 de forma muito mais expedita do que no passado. Estes métodos, o tempo necessário e a probabilidade de sucesso são revisados ​​em relação aos modelos de demência do mouse. O alvo de genes e as tecnologias transgênicas têm diferentes pontos fortes e fracos em relação à fidelidade à doença, minimizando a variação e evitando conseqüências não intencionais. A geração de camundongos geneticamente manipulados para qualquer finalidade envolve tempo e despesa significativos. Este investimento é amplificado no caso de modelos de demência por causa do componente de envelhecimento em muitos modelos de demência. Meu objetivo no seguinte é ajudar o investigador a fazer escolhas sábias na seleção de tecnologias, de modo que a variação indesejada seja minimizada e a fidelidade à doença possa ser maximizada. Este não é um livro de receitas sobre como realizar segmentação gênica ou transgênicos voltados para núcleos transgênicos ou direcionados, mas destina-se a ajudar o investigador a tomar decisões sobre quais abordagens são mais adequadas para atingir seus objetivos experimentais, destacando algumas das armadilhas associadas à Diferentes abordagens. Transgênicos e segmentação genética Nos transgênicos, o DNA é inserido aleatoriamente no genoma, injetando o núcleo de inchaço do esperma logo após a adubação (1). Os embriões injetados são transferidos para camundongos fêmeas receptores. Cerca de 20 da prole terão o DNA injetado inserido em seu genoma. Cada uma das descendentes positivas ao transgene é utilizada para estabelecer uma linha de prole que transporta a inserção do transgene criando animais fundadores para camundongos de tipo selvagem da cepa apropriada. Na segmentação por genes, as mudanças são introduzidas em um gene endógeno usando recombinação homóloga com DNA manipulado desse gene (2, 3). A segmentação por genes é realizada em células embrionárias (ES) em cultura. Como a segmentação gênica é um evento raro, os minigenes de seleção de drogas são incorporados na construção de DNA direcionada, e as linhas celulares direcionadas a genes de boa fé devem ser identificadas dentre as células que sobrevivem à seleção de drogas. A fração de células corretamente segmentadas nas células que sobrevivem à seleção pode ser tão grande como um quarto, mas pode ser muito menor. As linhas celulares são rastreadas para recombinação homóloga em um lado da construção alvo, então as linhas celulares positivas são propagadas e caracterizadas com mais detalhes para garantir que a recombinação homóloga tenha ocorrido em ambos os lados, e todos os elementos que devem ser introduzidos no gene foram de fato recombinados In. As linhas celulares corretamente direcionadas são analisadas para garantir que elas tenham o número correto de cromossomos, uma vez que as linhas celulares aneuploides raramente transmitem através da linha germinativa. As linhas celulares Euploid, corretamente segmentadas são combinadas com embriões receptores, e os embriões quiméricos são transferidos para uma fêmea hospedeira. As células ES e o embrião hospedeiro são tipicamente marcados por diferentes genes de cores do revestimento e, tipicamente, as quimeras são acopladas a camundongos de uma cor de revestimento escolhida, de modo que a prole derivada do componente celular ES pode ser distinguida daqueles derivados do embrião hospedeiro. A metade da prole derivada do ES deve levar o gene alvo. Mecanismo Genético de Doença e Escolha de Tecnologias Deve ser considerado o mecanismo genético da doença a modelar. Os mecanismos genéticos típicos da doença incluem mutações que eliminam a função genética, mutações que alteram a atividade gênica e mutações que aumentam o número de cópias de genes. Se uma doença resulta da perda completa da função (uma mutação nula), o gene pode ser inativado por segmentação de genes (knockout de genes). Ambos os traços recessivos homozigotos (ambas as cópias de genes inativadas por mutação) e características insuficientes (uma cópia de gene inativada) podem ser modeladas por nocaute de genes. Se uma doença resulta de uma actividade aumentada ou nova do produto do gene, podem ser utilizados quaisquer transgenes que expressam o produto mutante, ou alterações de sequência alvo (knockin) para o gene endógeno. Se as mutações levam a perda parcial da função, a segmentação gênica pode ser usada para introduzir uma mutação comprometida específica no gene endógeno (knockin). Se a doença se deve ao aumento do número de cópias de genes, os transgenes podem ser usados ​​para aumentar o número de cópias de genes. Além disso, considere que, embora muitas mutações causadoras de doenças não sejam mutações completas de perda de função (mutações nulas), as mutações nulas são a mutação mais informativa para a função normal do gene e podem ser usadas em conjunto com mutações causadoras de doenças Para entender melhor os mecanismos moleculares. Minimizar a variação não desejada Uma força de modelos animais é que a variação pode ser minimizada, de modo que as experiências podem ter maior sensibilidade. Minimiza os resultados da variação se o fundo genético, o ambiente e o estado epigenético forem uniformes. Evidentemente, a variação no fenótipo pode surgir diretamente se mutações diferentes no locus causador da doença tiverem diferentes efeitos na atividade gênica, mas essa variação é aparente e no controle do investigador. A variação pode surgir através da interação de uma mutação causadora de doença com variantes segregantes em outros lugares do genoma. Os efeitos dessas interações genes-genes podem ser bastante grandes (4) e esses tipos de interações que afetam a gravidade do fenótipo da doença foram observados para os modelos de demência (5-8). Muitas estirpes de mouse que não têm nenhuma variação genética estão disponíveis - cepas endogâmicas -, portanto, a variação devido a interações variáveis ​​de genes-genes pode ser minimizada. Os modelos genéticos podem ser gerados diretamente em um pequeno número de cepas endogâmicas, ou uma variante genética pode ser gerada e cruzada para a linhagem de escolha intima. As características das cepas inatas, quais são passíveis de manipulação genética e os detalhes práticos da criação de modelos de ratos consanguíneos são discutidos abaixo. A expressão de genes variáveis ​​no locus causador da doença pode surgir devido à variação epigenética. A metilação do DNA e a estrutura da cromatina são hereditárias de célula a célula, e mesmo de geração em geração, em alguns casos. O problema é que o estado epigenético não é completamente estável e pode mudar estocásticamente, de um permissivo para expressão, para um que não é. A maioria dos genes no genoma provavelmente não tem variação estocástica no estado epigenético, mas é bastante comum em DNA estrangeiro experimentalmente inserido no genoma, particularmente nas regiões intergênicas. Supõe-se que o silenciamento epigenético do DNA introduzido é um mecanismo protetor contra o DNA estranho, como pode surgir da inserção do genoma viral. A probabilidade de silenciar é influenciada pela natureza do DNA inserido e pelo estado epigenético do DNA que envolve a inserção (9-11). Importante, a variação no estado epigenético é exacerbada com pequenos transgenes inseridos em grande número em um único site. Os transgenes são inseridos em repetições diretas (em tandem, de cabeça para cauda) em um único site. Para pequenos transgenes, a matriz pode conter centenas de cópias. A natureza repetitiva do conjunto de transgenes promove o silenciamento epigenético (12-14). O silenciamento epigenético em um conjunto de transgenes pode variar de célula para célula, pode aumentar com a idade e pode variar de animal para animal (10, 12, 15). As matrizes de Transgene, uma vez silenciadas na linha germinativa, geralmente permanecem silenciosamente silenciosas de geração em geração (16-18). Assim, é importante monitorizar a expressão gênica de geração em geração em camundongos transgênicos com grandes matrizes de transgênios. As práticas modernas de habitação do mouse procuram eliminar a variação ambiental através do controle de ventilação, temperatura, umidade, ruído, vibração, fotoperíodo, enriquecimento, agentes infecciosos e dieta. Embora a habitação e os cuidados veterinários dos camundongos sejam tipicamente administrados por pessoal de cuidados com os animais e veterinários de uma instalação animal, os investigadores devem ter um interesse ativo no estado de habitação, cuidados e doenças infecciosas de seus animais para garantir que os padrões declarados sejam atendidos e os procedimentos seguidos . As perturbações ambientais podem vir de fontes inesperadas. As unidades de alojamento do mouse consistem em parte de plástico que entram em contato com os ratos. Quando as gaiolas feitas de policarbonato e de polissulfona degradam, libertam o composto estrogênico bisfenol A (19, 20). A enchedora de polissulfona é mais estável que o policarbonato, liberando menos bisfenol A (19). Os plásticos visivelmente degradados ou prejudicados devem ser removidos do uso. Artefatos da manipulação genética As manipulações genéticas ocasionalmente têm conseqüências não intencionais. As inserções de Transgene podem interromper fisicamente os genes em seu local de inserção. A freqüência de fenótipos decorrentes da mutação do local de inserção por um transgene (quase 10) é maior do que o esperado pela integração aleatória no genoma. A taxa de mutação superior à esperada resulta porque os transgênicos gerados pela injeção pronuclear podem gerar grandes deleções e rearranjos complexos no local de integração do DNA (21-31). Se um transgene não pode ser homozigoto, ou os camundongos homozigotos têm um fenótipo inesperado, isso pode indicar que há um efeito do local de inserção. Além disso, se um fenótipo inesperado não for visto em outras linhas de camundongos de diferentes camundongos fundadores com o mesmo transgene, o fenótipo pode ser devido ao local de inserção. Assim, é prudente gerar múltiplas linhas de camundongos transgênicos de animais fundadores independentes e comparar os fenótipos dessas linhas. Além da interrupção física direta de genes, integrações também podem ter efeitos sobre a expressão de genes vizinhos (32-35). Este efeito mais indireto foi observado em alguns knockouts de genes bem caracterizados, mas, em princípio, esse fenômeno poderia se aplicar aos transgenes também. Onde os efeitos indiretos nos genes vizinhos foram observados, o efeito é devido a um marcador selecionável minigene introduzido no gene endógeno, mutado. Na maioria dos casos em que esse fenômeno foi observado, os genes vizinhos afetados estão próximos do gene alvo e estão intimamente relacionados ao gene alvo. Em genes knockouts, os efeitos na expressão de genes vizinhos podem ser minimizados através da concepção de knockouts com a cassete de genes de resistência a fármacos flanqueada por sequências de reconhecimento para uma recombinase específica do local (tais como sites Frt ou LoxP para a recombinação Flpe ou Cre, respectivamente). Os minigenes de resistência ao fármaco podem ser removidos após o alvo por expressão transitória de recombinase em células ES ou atravessando o knockout a um mouse que expressa recombinase na linha germinativa. As linhas transgênicas individuais feitas com promotores caracterizados e transgenes pequenos são ocasionalmente expressadas ectopicamente. Essa expressão aberrante pode ser devido a influências do site de integração e é observada com mais freqüência com promotores fracos. Estirpes de camundongos de linhagem Indoe existe um grande número de cepas de ratos existentes, mas apenas um pequeno número é comumente usado para produzir transgênicos ou camundongos alvo de genes. As cepas puras C57BL6, 129 e FVB são comumente usadas para gerar camundongos geneticamente alterados. As cepas endogâmicas são menos robustas do que as estirpes híbridas na produção knockout e transgênica, mas se os objetivos experimentais forem melhorados com uma cepa ingerida, é aconselhável começar com uma cepa inata para evitar quase dois anos e meio necessários para atravessar os ratos Para um novo plano de fundo. A escolha da tensão depende das características da cepa, incluindo a susceptibilidade à doença e se outras variantes genéticas de interesse estão naquela cepa. As cepas endogâmicas diferem na susceptibilidade ao fenótipo da doença, bem como na neuroanatomia, acuidade sensorial e proficiência em testes comportamentais (36). A estirpe bovina C57BL6 tem neuroanatomia relativamente normal e é suscetível a fenótipos de demência (5-8, 37), e muitas variantes genéticas foram estabelecidas em C57BL6J. C57BL6J tem perda auditiva relacionada à idade (38) e é suscetível a dermatite (39). 129 camundongos tipicamente têm um pequeno corpo caloso e funcionam mal em testes de aprendizagem (37, 40) e podem ter uma gravidade reduzida do fenótipo de demência (5). A estirpe FVB é cega devido à degeneração da retina e, portanto, desempenha mal em ensaios comportamentais que requerem visão (41-43). Menos variantes genéticas estão disponíveis em 129 e FVB do que em C57BL6J. Embora haja apenas um pequeno número de estudos até agora, os camundongos C57BL6 e FVB parecem ser mais suscetíveis à patologia da doença de Alzheimer e Huntington do que 129 camundongos. No passado, a maior parte da segmentação gênica foi feita em células ES de 129 camundongos. No entanto, recentemente, as linhas celulares de C57Bl6J e C57BL6N estreitamente relacionadas tornaram-se amplamente utilizadas (44, 45). Além disso, os transgênicos podem ser feitos diretamente no C57BL6J (46). Serão considerados três tipos de transgenes: pequenos transgenes à base de cDNA, transgenes genómicos baseados em DNA e sistemas duplos transgênicos (digênicos). Pequenos transgenes à base de cDNA consistem em um promotor, uma sequência de codificação de proteína completa de um cDNA e um sinal de poliadenilação clonado em um plasmídeo de alto número de cópias. Um intrão às vezes é incluído na construção para aumentar a expressão (47, 48). Estes elementos são clonados no plasmídeo de modo a que o transgene possa ser libertado de uma só peça a partir do esqueleto do plasmídeo por digestão com endonuclease de restrição e a construção sem esqueleto isolada a partir de um gel. A espinha dorsal não está incluída no DNA injetado, uma vez que a coluna vertebral promove o silenciamento epigenético (49, 50). O DNA injetado faz uma série de cópias de cabeça para cauda, ​​que se insere em um único site no genoma (1). O nível de expressão dos produtos codificados por transgene tipicamente não se correlaciona com o número de cópias do transgene que foram inseridas para estes transgenes à base de cDNA (12). Diferentes fundadores transgênicos podem ter diferentes níveis de expressão, e esta variação pode ser usada para investigar se o fenótipo varia com o nível de expressão do transgene. A expressão de um transgene desse tipo pode ser consideravelmente maior que a do gene endógeno. Promotores que conduzem expressão de transgene específica ou específica para o tecido foram desenvolvidos. Uma lista de promotores específicos do cérebro caracterizados que foram utilizados em modelos de demência está listada no material suplementar para Gotz e Ittner (51). Resumidamente, os promotores que foram utilizados para criar modelos de demência incluem aqueles dos genes Thy1 (Thy1.2), Prnp (PrP), Pdgfb (Pdgf-beta, PDGF), Camk2a (CAMKII), Eno2 (NSE) e GFAP. Esses genes variam em seu padrão espacial de expressão e o nível de expressão. O promotor Thy1.2 gera uma expressão forte na maioria ou em todos os neurônios, começando nos estágios pós-natal precoce (52, 53). O promotor Prp promove forte expressão nos neurônios no hipocampo, nas células de Purkinje e em alguns outros tipos de células neuronais (54). O promotor do PDGF conduz a expressão moderada nos neurônios do córtex e do hipocampo (55). O promotor CAMKII desenvolve a expressão pós-natal em neurônios derivados do prosencéfalo (56). O promotor NSE desenvolve expressões fortes nos neurônios pós-mitóticos, começando no dia embrionário 9,5 (57). O promotor GFAP gera expressão robusta em astrocitos. (58) A sequência de codificação tipicamente é derivada de um cDNA de comprimento total. Mutações ou tags podem ser incorporados na sequência de codificação por muitos métodos diferentes. Os sinais de poliadenilação são necessários para que o ARN codificado em transgene se acumule. A AAAAA na região 3 não traduzida de mRNAs típicos não é suficiente para promover a clivagem e a poliadenilação de 3 extremidades neste contexto. Duas sequências de poliadenilação diferentes são de uso comum: as sequências de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino e do SV40 (59, 60). Dada a propensão de pequenos transgenes a serem silenciados epigeneticamente em camundongos, e para caracterizar completamente diferentes linhas transgênicas para expressão, planeje monitorar a expressão dos produtos transgênicos. Idealmente, a proteína codificada por transgene é monitorada, em vez de o RNA. Isto pode ser conseguido se a proteína for de uma espécie diferente e os anticorpos específicos de espécies estão disponíveis, se os anticorpos detectarem a forma mutante codificada pelo transgene da proteína, ou a proteína é marcada com um epitopo. Recentemente, grandes fragmentos genômicos contendo genes inteiros tornaram-se mais fáceis de manipular para gerar camundongos transgênicos (61, 62). As bibliotecas de DNA genômico de fragmentos grandes em vetores de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) foram feitas de muitas espécies, incluindo seres humanos e muitas cepas de camundongos. O tamanho médio do ADN genômico clonado (tipicamente 150 kb) é tal que a maioria dos genes e as sequências de ação cis requeridas para a sua expressão podem ser contidas dentro de um único clone (63). Os clones de BAC são estáveis ​​em seus hospedeiros bacterianos e podem ser isolados com grandes kits de purificação de plasmídeos comerciais (64). Algumas dessas bibliotecas, humanas e de mouse, tiveram muitos clones seqüenciados em ambas as extremidades. As seqüências finais emparelhadas foram usadas para azulejar os clones nas montagens do genoma (65-67). Os clones parcialmente sequenciados estão disponíveis para compra em seus hospedeiros bacterianos. Muitos clones genômicos de BAC, quando injetados como transgenes em camundongos, recapitulam o padrão temporal e espacial normal de expressão do gene endógeno em níveis de expressão comparáveis ​​(63). Uma tecnologia para a introdução de mutações nos clones BAC, recombinação, está disponível (64, 68-70). Se o uso da tecnologia de recombinação será limitado a um pequeno número de construções, pode ser conveniente usar um serviço de recombinação comercial. Os clones genômicos em vetores BAC são tipicamente injetados como moléculas circulares intactas incluindo o vetor. O DNA se concatena e um pequeno número de cópias intactas se integram em um único site (71). Ao contrário de pequenos transgenes baseados em cDNA, o nível de expressão desses grandes transgenes correlaciona-se com o número da cópia (71, 72). O silenciamento epigenético não foi relatado como um problema com esses transgenes grandes, presumivelmente porque se assemelham aos genes do mouse em vez de DNA estrangeiro. A detecção da expressão a partir de clones de BAC de ratinho não modificados pode ser difícil devido à semelhança ou identidade com o gene endógeno, assim, a utilização de clones humanos, ou a marcação ou modificação de uma sequência de codificação de rato por recombinação deve ser considerada. Grandes fragmentos de DNA genômico clonados em vectores de cromossomas artificiais de fermento (YAC) também foram usados ​​para gerar camundongos transgênicos. Embora as bibliotecas de vetores YAC tenham fragmentos de DNA maiores em média, os clones são muito mais propensos ao quimerismo do DNA, são muito mais difíceis de isolar e usar para gerar transgênicos do que os clones BAC (73). O controle temporal da expressão é possível com os sistemas digenais de transgenes. As mais prevalentes são as variantes do fator de transcrição regulado por tetraciclina (74-76). Um transgene do par consiste em um transgene respondedor com a sequência de codificação alvo sob o controlo de um promotor mínimo e locais de ligação para o factor de trans-acção. A actividade do factor de trans-acção é regulada pela ligação do análogo de tetraciclina doxiciclina, que é fornecido na água potável. O factor de trans-ação é tipicamente expresso a partir de um promotor específico do tecido em um segundo transgene estabelecido independentemente. Os dois transgenes são reunidos pela reprodução. Desta forma, tanto o tempo como o tecido de expressão podem ser controlados com precisão. Vários genes do driver bem-caracterizados estão disponíveis. A maioria, mas não todos os componentes dos sistemas digênicos, são transgênios pequenos e, portanto, são suscetíveis ao silenciamento epigenético que afeta os transgenes à base de cDNA. Portanto, o monitoramento da expressão de ambos os transgenes do sistema digênico pode precisar ser incorporado ao plano de pesquisa. Para a criação de modelos de demência, os transgenes BAC possuem as vantagens da expressão que imitam melhor o gene endógeno e a resistência relativa ao silenciamento epigenético. Para experiências que requerem uma expressão de alto nível de um produto de transgene, a abordagem do transgene à base de plasmídeo funciona bem. Se o controle sobre o tempo de expressão do produto transgene for desejado, o sistema regulado pela tetraciclina seria mais adequado. O contexto genético de escolha é a estirpe bovina C57BL6J. Estratégias de segmentação de genes Na segmentação por genes, um gene endógeno pode ser alterado de uma ampla variedade de maneiras: ele pode ser tornado não funcional ao excluir seqüências essenciais (knockout de genes), ter seqüências substituídas ou adicionadas (knockin de genes) ou transformadas em um mutante condicional ( Por exemplo, um alelo floxed). Como o DNA genômico usado para construir o vetor de segmentação precisa ser da mesma cepa que a linha celular (77), primeiro deve ser tomada uma decisão sobre qual linha celular ES usar. Historicamente, a maior parte da segmentação gênica foi feita em linhas derivadas da 129 linhagem ingerida. As linhas celulares derivadas de 129 foram mais capazes de manter seus cromossomos em cultura e, portanto, eram mais propensas a transmitir as mutações através da linha germinal de camundongos (78). Recentemente, uma série de excelentes linhas celulares tornaram-se disponíveis a partir de ratos C57BL6N (45, 78-80). C57BL6N e C57BL6J divergiram em 1951. Existem algumas diferenças genéticas conhecidas entre as duas cepas, incluindo uma mutação nula na nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (Nnt) em C57BL6J não presente em C57BL6N (81). Após a segmentação em C57BL6N, as quimeras podem ser criadas diretamente para C57BL6J. Se as diferenças genéticas conhecidas são uma preocupação, elas podem ser eliminadas em duas cruzes para C57BL6J monitorando as variantes na prole. Os clones genômicos de sequenciação final em vetores BAC, que podem ser usados ​​para a construção de vetores de segmentação, estão disponíveis tanto para 129 quanto para C57BL6J (65, 66). A segmentação por genes tem grande fidelidade à genética da doença, uma vez que o gene endógeno é alvo. No entanto, existem desvantagens para a segmentação por genes. A produção de um modelo de mouse por segmentação de genes leva mais tempo do que por transgênicos. Importante, o sucesso está menos seguro com a segmentação gênica que com transgênicos. Ocasionalmente, um vetor de segmentação de genes não produzirá linhas celulares direcionadas a genes. Não está claro por que a segmentação falha nesses casos, e a resolução usual envolve aumentar a extensão do DNA homólogo ou escolher uma parte diferente do gene para atingir. Na nossa experiência, cerca de 80 vetores de segmentação de genes visam com êxito. Além disso, apenas cerca de 80 linhas de células ES com um número normal de cromossomos serão transmitidas através da linha germinativa. Se várias linhas de células direcionadas corretamente foram geradas, essa segunda questão pode ser superada fazendo quimeras com duas ou mais linhas celulares para cada experiência de segmentação. Linha de tempo para transgênicos e segmentação de genes Movendo uma mutação ou transgene para uma linhagem inata exige nove cruzamentos consecutivos para ratos da estirpe alvo, incluindo pelo menos uma cruzada em cada sexo. Este processo leva um mínimo de mais de dois anos. O DNA intimamente ligado à variante do gene permanecerá na tensão original sobre a qual a variante foi gerada. Nos transgênicos, são 3 semanas a partir da injeção de DNA ao nascimento da prole, 3 semanas para o desmame quando os camundongos contendo o DNA injetado podem ser identificados e outras 3 a 5 semanas para fêmeas e machos, respectivamente, para atingir a maturidade sexual. A transmissão do transgene na prole requer 6 semanas para a prole desmamada. Assim, é necessário um mínimo de 15 a 17 semanas a partir da injeção de DNA até que um transgene de um mouse fundador seja estabelecido em camundongos múltiplos, o início de uma linha de camundongos transgênicos. Na segmentação por genes, leva um mínimo de 8 semanas para eletroporar a construção de DNA e fazer uma caracterização inicial de linhas celulares para identificar possíveis clones segmentados e, no mínimo, mais 6 semanas para caracterizar completamente linhas celulares direcionadas para a construção de quimeras. A partir da injeção de células-tronco embrionárias direcionadas em embriões hospedeiros, leva 12 semanas para que as quimeras atinjam a maturidade sexual e outras 6 semanas para a prole desmamada que será testada para a transmissão da linha germinativa. Assim, é necessário um mínimo de 32 semanas após o vetor de segmentação ser construído para alcançar ratos heterocigotos com genes alvo. Essas linhas de tempo não incluem o tempo necessário para construir construções de DNA ou desenvolver ensaios para identificar camundongos fundadores ou células ES segmentadas. As construções de DNA para segmentação gênica são mais complicadas de construir e a verificação de segmentação gênica é mais envolvida que a identificação de camundongos transgênicos. Fontes de Serviços, Materiais e Informação Alguns serviços de transgênicos e direcionados acadêmicos receberão pedidos de clientes de fora de sua instituição. Seus preços geralmente são substancialmente inferiores aos serviços comerciais. O navegador do genoma UCSC ltgenome. ucsc. edu gt exibe clones genômicos BAC terminados em sequência, espalhados por todo o genoma para camundongos e seres humanos. Esses clones podem ser comprados no The BACPAC Resources Center ltbacpac. chori. org gt. Os clones genômicos do mouse são de C57BL6J ou Mus musculus molossinus, então certifique-se de selecionar a biblioteca correta. O navegador Genome Ensembl ltensembl. orgMusmusculusindex. html gt exibe 129 clones genômicos seqüenciados em sequência que podem ser comprados no Wellcome Trust. Os núcleos transgênicos podem ajudá-lo a identificar fontes de promotores, sinais de poliadenilação e marcadores selecionáveis ​​e seus acordos de transferência de material. O Laboratório Jackson mantém o site e o banco de dados de informática do genoma do mouse (MGI), que é uma fonte inestimável de informações sobre a nomenclatura, mutantes de mouse existentes, cepas de ratos e repositórios públicos de camundongos. O grupo de discussão por e-mail MGI é uma boa maneira de obter informações de geneticistas de ratos em outras instituições. Uma série de núcleos transgênicos, incluindo os nossos, mantêm sites com uma boa quantidade de informações básicas sobre genética, reprodução e biologia de ratos (UC Irvine ltresearch. uci. edutmfindex. htm gt, U of Michigan ltmed. umich. edutamc gt e CWRU Ltko. cwru. edu gt). O advento das bibliotecas genômicas BAC e recombinação, combinado com a capacidade de fazer transgênicos diretamente na cepa C57BL6J, conduziram a grandes melhorias na geração de modelos animais de doenças. Em muitos casos, um modelo de demência pode ser rapidamente estabelecido, que tem baixa variação e alta fidelidade à genética da doença. Por outro lado, o desenvolvimento recente de linhas C57BL6 ES estáveis ​​facilitou a segmentação gênica. No entanto, a segmentação por genes requer mais tempo e é menos segura de ter sucesso. Os pontos fortes e fracos de diferentes abordagens estão resumidos na Tabela 1. 1. Brinster RL, Chen HY, Trumbauer M, Senear AW, Warren R, Palmiter RD. Expressão somática de heredina timidina quinase em camundongos após a injeção de um gene de fusão em ovos. Cell 198127 (1 Pt 2): 223-31. 2. Thomas KR, Capecchi MR. Mutagênese direcionada ao site por segmentação gênica em células-tronco derivadas de embriões de mouse. Cell 198751 (3): 503-12. 3. 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